Transferencia de intervalos de referencia en Valencia-Venezuela / Transference of reference intervals in Valencia-Venezuela / Transferência de intervalos de referência em Valência-Venezuela

El objetivo de la presente investigación consistió en revisar si los valores de referencia producidos por la industria de diagnóstico in vitro eran transferibles a una determinada población. Para este estudio fueron analizadas muestras de suero de una población de 23 individuos. El análisis de las muestras estudiadas fue realizado mediante el método de colorimetría usando equipos Rx Daytona. Los analitos determinados para el estudio fueron glucemia, colesterol, triglicéridos por método enzimático y creatinina por método cinético, empleando el kit de reactivos de la misma casa comercial del instrumento. Para la evaluación y análisis estadístico de los datos fue empleado el logaritmo de decisión propuesto por Ventimiglia y Fink en 2002. Como resultado se obtuvieron porcentajes de transferibilidad de 100% para la totalidad de los analitos. De acuerdo con los resultados obtenidos, se dieron por verificados y se aceptó la transferibilidad de los intervalos de referencia comerciales para la población en estudio.

The aim of this investigation was to review if the reference values produced by the in vitro diagnostic industry were transferable to a specific population; for the study, serum samples from a population of 23 individuals were analyzed.The analysis of the samples was carried out using the colorimetric method with Rx Daytona equipment. The analytes determined for the study were glycemia, cholesterol, triglycerides by enzymatic method and creatinine by kinetic method, using the reagent kit from the same commercial brand of said equipment. The statistical analysis was done applying the decision logarithm proposed by Ventimiglia F and Fink N (2002). As a result, percentages of 100% of transferability were found on all the analytes. According to the results obtained, the transferability of the commercial reference intervals for the population under study was accepted.

O objetivo da presente investigação foi revisar se os valores de referência produzidos pela indústria de diagnóstico in vitro eram transferíveis para uma população específica. Para esse estudo amostras de soro foram analisadas de uma população de 23 indivíduos. A análise das amostras estudadas foi realizada utilizando o método de colorimetria, utilizando equipamentos Rx Daytona. Os analitos determinados para o estudo foram glicemia, colesterol, triglicerídeos pelo método enzimático e creatinina pelo método cinético, utilizando o kit de reagentes da mesma casa comercial do instrumento. Para a avaliação e análise estatística dos dados foi utilizado o logaritmo de decisão proposto por Ventimiglia F e Fink N 2002. Como resultados, percentuais de transferibilidade de 100% foram obtidos para todos os analitos. De acordo com os resultados obtidos, foram tidos como verificados e se aceita a transferibilidade dos intervalos de referência comerciais para a população em estudo.

Desenvolvimento de epiderme humana reconstruída (RHE) como plataforma de testes in vitro para irritação, sensibilização, dermatite atópica e fotoimunossupressão / Development of a Reconstructed Human Epidermis (RHE) as platform to in vitro assays: irritation, sensitization, atopic dermatitis and photoimmunosuppression

O desenvolvimento de novos modelos de pele e novas metodologias in vitro segue uma tendência mundial na busca pela redução ou substituição de testes em animais. Nesse contexto, kits de epiderme humana reconstruída (RHE) apresentam-se como uma plataforma promissoras para essa proposta e, alguns modelos encontram-se validados para ensaios de irritação e corrosão cutânea in vitro. Entretanto, em países como o Brasil, enfrentam-se questões alfandegárias e perda do material por perecibilidade, dificultando e até impedindo, a importação desses kits para utilização por parte das indústrias e laboratórios nacionais. Em contrapartida, o desenvolvimento de um modelo de RHE apresenta-se como um avanço tecnológico e ganho de autonomia para esses países. Assim, no capítulo 1 explorou-se o desenvolvimento de um modelo nacional de RHE (USP-RHE) que atendesse às exigências internacionais descritas no guia OECD 439. O modelo desenvolvido apresentou uma epiderme bem diferenciada e atendeu aos parâmetros de qualidade (histologia, viabilidade e função barreira) bem como da funcionalidade, a qual é expressa na capacidade de distinção entre irritantes e não irritantes, apresentando 85,7% de especificidade, 100% sensibilidade e 92,3% de acurácia quando comparada com a classificação in vivo obtida pelo ensaio do linfonodo local (LLNA). No capítulo 2, células monocíticas THP-1 em monocamada foram capazes de distinguir entre agentes sensibilizantes e não sensibilizantes por meio da expressão de CD86, CD54 e liberação de IL-8. Após a obtenção de RHE e THP-1 funcionais, um cross-talking foi estabelecido gerando uma RHE imunocompetente. A RHEI distinguiu satisfatoriamente entre agentes sensibilizantes e não sensibilizantes por meio da expressão de CD86 e CD54 na membrana das células THP-1. A liberação de IL-8 também foi avaliada na RHEI, mas, não demonstrou ser um bom indicador para a avaliação de sensibilização, ao contrário de IL-1α, que distinguiu satisfatoriamente agentes sensibilizantes de não-sensibilizantes, mas não foi capaz de hierarquizá-los. No capítulo 3, avaliou-se o papel de interleucinas do tipo Th2 e da depleção de colesterol na membrana plasmática no desenvolvimento de características morfológicas e moleculares da dermatite atópica (DA) in vitro em um modelo de RHE. Os resultados demonstram que o uso de IL-4, IL-13 e IL-25 em combinação com a depleção de colesterol na membrana plasmática mimetiza in vitro, as principais características da DA. No capítulo 4, buscou-se avaliar os efeitos imunossupressores da radiação ultravioleta na RHEI. Os ensaios foram realizados em diferentes períodos de exposição, entretanto, não foi possível observar tais efeitos. Os resultados justificam-se pela ausência da liberação de IL-10 pelo RHE imunocompetente, por exemplo, e demonstram uma limitação do RHE imunocompetente para avaliações de inativação da reposta imune. Neste trabalho, concluímos que foi possível obter uma RHE competitiva, similar aos modelos internacionais validados e que pode ser utilizada como plataforma para ensaios de irritação e sensibilização cutânea, além de ser uma plataforma para estudos da dermatite atópica. No modelo é possível estudar a ativação do sistema imune, o que o torna promissor como uma plataforma para avaliação de resposta imunológica in vitro. Conclui-se, portanto, que os objetivos foram amplamente atendidos além de oferecermos um protocolo de livre acesso para reprodução por outros laboratórios e um modelo para validação futura

The development of new in vitro skin models and new methodologies follows a global trend in search for reductions or replacement of animal testing. In this context, Reconstructed Human Epidermis kits (RHE) are presented as a promising platform in the search for alternative methods to animal use, and some models are validated for skin irritation and corrosion in vitro tests. However, in countries such as Brazil, who face customs issues and loss of material due to perishability, making it challenging and even compromising the importation of these kits for use by industries and laboratories. In contrast, the development of an RHE model is presented as a technological breakthrough and gain of autonomy for these countries. Thus, in Chapter 1 we explored the development of a national model of RHE (USP-RHE) that meet international requirements described in OECD TG 439. The developed model presented a well-differentiated epidermis and met the quality parameters, for instance, histology, viability, and barrier function as well as the functionality expressed in the capacity of screening between irritants and nonirritants, with 85.7 % of specificity, 100 % of sensitivity and 91.7% of accuracy in comparision to in vivo UN GHS classification from Local limph node assay (LLNA). In chapter 2, monocytic THP-1 cell line, as monolayers, were able to distinguish between sensitizers and non-sensitizers by expression of CD86, CD54, and IL-8 release. In this model, functional RHE and THP-1 were used in a cross-talking, and thus an immunocompetent RHE (RHEI) was generated. The RHEI has distinguished satisfactorily between sensitizers and non-sensitizers through CD86 and CD54 expression that was larger and more sensitive in this model. The release of IL-8 was also evaluated in RHEI, however, did not demonstrate to be a good parameter for this evaluation, unlike IL-1α, which satisfactorily distinguished sensitizers from non-sensitizers, but was not able to hierarchize them. In chapter 3, we evaluated the role of Th2-related cytokines and plasma membrane cholesterol depletion (CD) in the development of atopic dermatitis (AD) morphological and molecular characteristics in an in vitro model of RHE. The results showed that combination of IL-4, IL-13 and IL-25 in combination with CD can reproduce the major features of AD in vitro. In Chapter 4, we sought to evaluate the ultraviolet radiation-induced immunosuppressive effects in RHE. The tests were performed at different times. However, it was not possible to observe such effects. The results are justified by the absence of IL-10 release by RHEI, for example, and show a limitation of RHEI for rating inactivation of the immune response. In this work, we conclude that it was possible to obtain a competitive RHE similar to the validated international models that can be used as a platform for irritation and skin sensitization tests, besides being a platform for the study of atopic dermatitis. Using this model is possible to explore the activation of immune system, which makes it promising as a platform for the evaluation of immune response in vitro. We conclude, therefore, that the objectives have been met as well as it is offering an open source protocol for breeding by other laboratories, thus offering the RHE model developed here for future validation tests